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                ChIP-Seq

                ChIP-Seq

                染色質免疫共沈澱(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)是在體內環境中研究蛋白質與DNA 相互作用的經典實驗方法,廣泛應用於組蛋〓白修飾、特定轉錄因子的基因調控作用等相關領域。

                簡介

                ? ? ? ?隨□ 著新一代測序技術的發展和成熟,染色質免疫沈澱實驗與高通量測序的整合,能夠高效的在全基因組範圍內檢測與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA 區段,並且可以基於多個樣品進行差異分析。ChIP-seq 是精確、敏感、通量高且成本低廉的方她感觉很是甜蜜法,可實現目標蛋白在全基因組範圍內的全部結合位點的定位與測序。


                技術路線

                技術優勢

                測序策略

                收樣要求

                您能獲得的數據

                案例解析

                基於ChIP-seq 揭示轉錄因子ZEB1 轉錄調控新機制


                ? ? ? ?上皮- 間質轉化(Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)是腫瘤侵襲和轉移的首要步驟。Zeb1 是EMT過程中的關鍵轉錄因子之一,它與多種癌癥的發生發展有關,但在膠質母細胞瘤(GBM)中Zeb1 具體調節哪些基因還並不清晰。

                ? ? ? ?本文研究人員對細胞模型進行了基於Zeb1 的ChIP-seq,研究轉錄因子Zeb1 在全基因組範圍的結合情況,發現它在4,430 個基因上有高達6,879 個結合峰,但並非全都產生調控作用。Zeb1 在GBM 中是高表達的,作者使用shRNA 敲低Zeb1,72h 後觀察基因的表達變化,發現200 個基因下調,98 個基因上調。緊接著,結合基ζ因表達譜的分析,確認這些基因的變化是否受到Zeb1 的直接調控,結果發現Zeb1 的結合與多個基因的上下調均顯著相關。Zeb1 直接抑制的基←因(如Myo6, Shroom3, Pard6b,Nrxn3)GO富集到上皮細胞分化等,Zeb1 直接激活的基因(如Itgb1, Nrp2, Prex1 ,S100B)GO 富集到糖蛋白代謝過程等。同時,為了研究Zeb1 的結合特性,作者也對motif進行了分析,發現Zeb1 大量結合E-box 序列(CAGGTG )和HMG-box 序列(ACAAAG )。最終,通過研究證實,Zeb1 可以同時調控膠質母細胞瘤幹性∮基因表達的激活和抑制,而非傳統認為的EMT 因子是轉錄抑制因子。Zeb1 抑制作用的發揮需要結合DNA 上的E-box 序列,而Zeb1 的激活作用是通過間接招募Lef/Tcf 因子來促進基因表達(不激活Wnt 通路)。

                Rosmaninho P, et al. “Zeb1 potentiates genome‐wide gene transcription with Lef1 to promote glioblastoma cell invasion” The EMBO journal (2018) DOI 10.15252/embj.201797115(Impact factor: 10.557)


                ChIP-seq 結合轉錄組測序揭示慢性疼痛如何持續發生


                ? ? ? ?慢性疼痛是引起神經元和小膠質細胞特征改變的一種常見而且具有破壞性的條件,現已發現許多與慢性疼痛發展和維持相關的神經生物學機跟前制,其中異常的小膠質瘤響應在慢性疼痛患者的中樞神經系統中具有突出的作用。目前一個主要的未解決的問題是,為什麽在最初的傷害減輕或愈合之後,這種改變會長期持續下去。本文通過研究神經損傷引起的增強子損傷特異性的改變,揭示神經系統免疫細胞的表觀遺傳對慢性疼痛的影響。對四組脊髓神經結紮(SNL) 和假手術(sham) 後7 天小鼠的脊髓小膠質細胞分別進行轉錄組測序和H3K4me1 抗體富集ChIP-seq。轉錄組測序結果顯示,已知的小膠質細胞基因,如組織蛋白酶(Ctss)、趨化因子受體(Cx3cr1)等在小膠質細胞中高表達。與sham 組相比,107 基因(約占50%)表達量上調,其中17 個基因在SNL 樣本中顯著表達上調。將這些上調基因與小膠質細胞上調基因進行GO 富集分析,發現免疫反應相關terms 顯著富集,包括幹擾素γ、幹擾素β 和補體信號傳導。
                ? ? ? ?脊髓小膠質細胞H3K4me1 ChIP-seq 結果顯示sham 和SNL 小膠質細胞與皮質小膠質細胞的共有結合圖譜在很大程度上重疊。與sham 對照組相比,損傷的小膠質細胞有很多的差異結合的峰,發現了神經損傷後出現的36 個潛在增強子和12 個抑制區域。富集分析結果顯手掌略一偏移示,SNL 上調的H3K4me1 結合區域富集在免疫和炎癥反應通路中,例如由趨化因子和細胞因子介導的淋巴細胞和白細胞增殖與炎癥等。大腦中絕大多數蛋白質的半衰期都少於14 天,因◥此很難從蛋白的角度長遠地看出蛋白異常功能應如何維持。
                ? ? ? ?本文從表觀水平和轉錄水平進行驗證,發現許多潛在增強子區域在神經損傷發生的28 天仍然存在,而這個時間點大多數轉錄本變化已恢復正常,表明神經損傷造儿子成的持久性的後果可能隱藏在表觀基因組中。


                Denk F, et al. “Persistent alterations in microglial enhancers in a model of chronic pain”. Cell reports (2016)DOI:10.1016/j.celrep.2016.04.063(Impact factor: 8.032)


                研究趨勢

                ? ? ? ?ChIP-seq 主要用於研究蛋白質與核酸之間的相互作用,後可根據蛋白質的生物學功能對基因組進行註釋或者探尋調控機制。目前ChIP-seq 常與轉錄組學結合起來解決表觀修飾生物學問題的所在,例如轉錄因子的生】物學功能等。

                常見問題

                1. 哪进来就说些物種可以做ChIP-seq ?
                物種為2 倍體,基因拼接至染色體水平(NCBI),註釋完整(GTF 文件)即可。
                2. 陽性對照和陰性對照是什麽?
                陽性對照:一般用anti-RNA polymerase II 抗體,因為RNA polymerase II 是通用轉錄因子,在所有細胞中都能結合基
                因的核心啟動子區↓,因此理論上,ChIP 後PCR 會有條帶。一般陽性對照不進行測序。

                陰性對照:陰性對照分為mock 和input 兩種,二者均能起到減少假陽性的作用。mock:用普通IgG 為抗體,理論上不會ChIP 下來任何DNA 片段,因此作為陰性對照,但是由於非特異性結合,或者實驗過程,沒發生結合◤的DNA 清除不完全,可能會出現條帶,但是一般條帶亮度較弱。IgG 不需要進行測序,只是判斷IP 試驗中所選取的抗體是否特时间異。

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