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                非链】特异性转录组测序

                非链特异性转录组测序

                转录组(transcriptome)在广义上是指细→胞内全部转录产物的集合,狭义上是指细胞中所有转录本(mRNA)的集合。转录组测序通』常来说是指依托于高通量测序平台对细胞中的mRNAs进行测序。经过信息的整理和分析,可在不同的样本中挖掘具◎有意义的差异表达基因,研究可变剪⊙切,融合基因事件和在转录㊣水平上进行性⊙状定位等。转录组测序现已广泛的应用到科研基础研究,临床疾病研究和药物研↘发等领域。

                常规¤转录组测序根据实验样品的不同可分为真核生物转录组♀测序和原核生物转录组测序;根据建库时的方法和研∩究目的不同可分为链特¤异性转录组建库和非链特异性转录组建库;根据测序物种有无参考基因组可以分为有参基因组转录组◥测序和无参基因组转录组测序。

                技术路线

                有参考基因组的转录组测序


                无参考基因组的转录组测序

                技术优势

                测序策略

                测序策略
                PE100或PE150
                建议数据量

                真核生物:一般测序5-6G深度测序10G

                原核生物:一般测序1G深度测序5-10

                收样要求

                组织
                500mg新鲜植物样本,300mg新鲜动物样本注: 肿瘤组织优先选择RNAlater保存
                细胞
                >5*106悬浮/贴壁细胞
                血液
                >3ml全血/全血分离的有核细胞
                RNA总量
                >3 μg,浓度 >50ng/μl, RIN值>6.5
                对于较难进行取冷漠材的医学类样品,可以适当降低样本标准。



                您可以得ぷ到的数据分析

                有参非链特异性转录组生物信息学分析流程

                常规分析

                高级分析

                高通量序列与参考基因组比对

                测序数据质控分析

                基因表卐达量分析

                基因的可变剪切分析(真核生物)

                基因结构优化及新转录本预测

                SNP、InDel等基因结构变异筛查

                样本间基因差异表达分】析

                差异表达基因的KEGG和GO功能分析

                差异基因的蛋白■互作分析

                个性化定制分析



                无参(de novo)非链特异性转录组生物信息学分析流程


                常规分析

                高级分析

                测序数据质控分析

                参考序列拼接▓

                Unigene的长度统计及●功能注释

                Unigene的表达谱构建∑ 

                SSR分析

                ORF预测

                SNPs分析

                序列信息统计

                Unigene在样本之间各类差异▼基因表达

                Unigene的KEGG和GO功能分析

                差异基因的蛋白互作分析

                个性化定制分析

                案例解析

                利用肿瘤血小板╲RNA-seq发现直接利用血液在分子通路层面上诊断

                泛癌症、分辨不同癌症类型和〖鉴定癌症基因突变的方法

                (有参ξ转录组测序)

                肿瘤相关的血小板(Tumor-educated platelets, TEPs)在全身或病︻灶范围上会根据肿瘤的生长情况而改㊣变自身mRNA的表达。本研究对228个原发肿瘤或肿瘤◣转移患者和55个健康个@ 体血液中的血小板细胞进行了♀转录组测序,欲验证肿瘤血小板中mRNA的变化是否能指导◥癌症的诊断和分类。测序后,通过序列比对,共鉴定出5,003个已◣知的血小板mRNA生物标记,例如B2M, PPBP, TMSB4X, PF4等,同时也鉴定出了一些非编码RNA(lncRNAs)。

                癌症患¤者与健康个体相比,1,453种mRNA表达量提高,793种mRNA表达量下降。聚类分析结果显示癌症患者与健康个体的血小板细胞mRNA信息有较大差【异。随后,课题组基于差异表达基因,利用不同算法对6种不同的癌症类型进行诊断和区分,结果显示可达到较好的癌症▲分辨效果。

                本研究通过对血小板细胞进行转录组测序,发现了基于肿瘤相关血小板细ㄨ胞中mRNA的信息对肿瘤进行早期诊断和癌种区分的方法。


                Best, Myron G., et al. "RNA-Seq of tumor-educated platelets enables blood-based pan-cancer, multiclass, and molecular pathway cancer diagnostics."Cancer cell(2015): 666-676.(Imapct factor:27.407)



                A. 测序后分析5,003个mRNA的上下调表达◥情况(红色代表上调基因,蓝色代表下调基因)

                B.健康个体和肿瘤患者mRNA表达量差异热图(上方横条中红色代表健▼康个体,灰色代表肿瘤患者)


                蝾螈▓不同组织de Novo转录组测序鉴定与肢臂重生相关mRNA与其编码的蛋白质

                (无参转录组测序)

                哺乳动物的肢体再生能力非常有限,蝾螈却可以重生自身↑肢臂。对蝾▼螈再生肢臂的机制的理解并不透彻,其中一个重要的原因是蝾螈草泥马基因组巨大≡且不完整。本研究对蝾螈16种不同〖组织(包括肢臂胚芽组织、睾丸、肌肉、卵巢等)的共42个样品进行转录组测序,并de novo拼接测序数据,绘制出了一个近卐乎于蝾螈全转录组的图谱 (完√整率高达88%)。同时,通过对比分析肢臂再生组织★和其他组织的mRNA测序数据和表达『情况,并结@ 合先前文献,鉴定⊙出了在肢臂再生中特异性表达的转录本和其编码的蛋白;CIRBP和KAZALD1蛋白。本研究除完成高完整度的蝾螈全转录组▽图谱构建及注释外,还揭示了在蝾螈进行肢体重生中的重要基因,极大地填补了蝾螈肢体再生研究的空白,并为再生医学研究奠定了基础。


                Bryant, Donald M., et al. "A tissue-mapped axolotl de novo transcriptome enables identification of limb regeneration factors."Cell reports(2017): 762-776.(Impact factor: 8.282)


                A. 针对蝾螈16种不同组织样本的转录组测序和de novo拼接流程

                B. 159个在肢臂胚芽组织□中富集的mRNA和在各种组织中的表达热图,标黄的基因代表预测为可能与肢臂再生相关的基因

                研究趋势与研究热点

                寻找研究对象的重要性状、表型或生物标志物;

                构建研究对象在不同的处理条件下,或者不同表型研究对象的基因表达谱。寻找表达差异大的关键基因;

                研究对象时序性或空间〇特异性变化的主控因素;

                无参考基因组物种的基因表达谱构建;

                研究近缘物种之间的进化差异等。

                常见问题

                在进行转ぷ录组测序之后,可以通过哪些方法对目标转录本进行验证?
                在进行转录组测序后,生物信息学分Ψ析会展现出不同样品中差异较大或有特殊意义的转录本,为了对这些有意义的转▽录本进行验证和继续研究,qRT-PCR方法可通过对怜惜目标转录本的表达进行定量或定性验证▲。除此之外,还有Northern Blot,FISH(荧光原位杂交)和免疫荧光实验等方法地面也可用于测序结【果验证。

                转录组一般【要测多大的数据量才合适?
                转录组测序所需要的测『序量要根据多个因素考量确定,这些因素包括了待测物种转录组大♀小,待测物种转录组中基●因的数量和各类基∑ 因的丰度。不同的物种在以上因素的变化可▼能不同,因此为了保证数据分析结果的可靠性和准确性,我们建议客╲户一定要在测序之前对待测物种的转录组的大小进行评◆估。对于有参考基因▓组的物种,可以根究先前〗的经验,分析基因组信息⊙、编码基因个数、碱基数及丰度进行预测评估。大部分物种的︻测序量以6-8G为佳。而多倍体植物,例如八倍体小麦这类基因组较大且复眼皮也不眨一下杂的物种来说,我们推荐适当增加测序量至10-12G。

                转录组测序的数据质量影响因素主要有哪些?

                转录组测¤序的质量可能会受到以下因素的影响:(1)RNA严重的降解可能会影响建库与测序的质量 (2)过低的RNA起始量可能会影响建库与测序质呃量,可以通过适当地增加PCR循环数来解决 (3)转录组中基因丰度的较大差异可能会影响基因检测的分辨率,高丰度的基因可能会掩盖低丰◥度表达的基因。

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