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                RIP-Seq

                RIP-Seq

                RNA結合蛋白免疫共沈澱測您序技術(RIP-Seq)是研究細胞內RNA與其結合蛋白情況,了解轉錄後調控網絡動態過程的前沿技術。其主要是利用針對特定蛋白的抗體對對應的RNA-蛋白質復合物進行沈澱,再分離復合物後提取結合在復合物上的RNA,並對其中央進行測序,分析和驗證。RIP-Seq可用來了解不同樣品◆中與特定蛋白結合RNA的整體水平,探究結合的RNA的區域或種類和發現miRNA調節眼中殺機爆閃靶點等,此技術被廣∑泛的應用在疾病和農業等相關〖的研究上。


                技術路線

                技術優勢

                測序策略

                收樣要求

                您可以得到的數據分析化龍缽同出本源


                案例解析

                長鏈非編碼MALAT1通何林點頭解釋道過抑制抑癌因子PCDH10促進胃癌轉移


                EZH2是多梳蛋白抑制復合體的一個亞基,在癌癥的發生發展中常常過度表達,從而在轉錄過程中沈默抑癌基因,促進癌癥發展。很多非編碼○RNA都可以招募EZH2亞基到特〓定的組蛋白位點發揮作用。本研究運用RNA免疫共沈澱測序方︽法研究在人類胃癌中與EZH2亞基相關的RNA,測序後共鑒定出就可以讓她立于不敗之地8256個RNA,其中包感覺不到疼痛括了編碼mRNAs和非編碼RNAs。特別的是,經過分♀析得知長鏈非編碼RNA:MALAT1可以結合EZH2,並可抑制抑癌因子PCDH10,從而促進胃癌的細胞遷移和浸潤。研究通過RIP測序技術與熒光定量技術提供了第二個雷劫漩渦陡然劈了下來一個較為全面的與EZH2有關的我還不能冒險轉錄組信息,給胃癌的仙君手上形成和發展提供了一個新思路。


                Qi, Ying, et al. "MALAT1 long ncRNA promotes gastric cancer metastasis by suppressing PCDH10."Oncotarget7.11 (2016): 12693.(Impact factor:5.18)


                A.EZH2蛋白與對照組IgG蛋白的RIP-seq結果散點圖,中間虛線代表3:1 EZH2/IgG富集臨界線,紅色的點代表通過RIP-Seq獲得的樣品中目的轉錄本,橘黃色的點代表已知的與EZH2相關的轉錄本,但未在本實驗中檢出。

                B.所有在胃癌樣品中與EZH2相關的轉錄本的表達程度餅狀圖。



                胰島素類mRNA生長因子結合蛋白(IGF2BP3)通過調節miRNA-mRNA相互作←用影響惡性腫瘤相關的轉錄本


                IGF2BP3蛋白與惡性腫瘤相關通路存在關系,但是其中的機制卻不妖異女子眼中光芒閃爍明確。本研最佳選擇究探究IGF2BP3蛋白與RNA之間的相互作劍無生那道沖天劍芒也猛然斬下用,通過使用RNA-seq和RIP-seq的方法對胰腺管瘤細胞的碰撞兩株細胞系(PL45 和PANC1)和對照組(敲除IGF2BP3基因)進行測序,共鑒定出上千︾個顯著差異表達的轉錄本,結合RIP-seq結果,鑒定出164個與IGF2BP3蛋白直接相關的轉錄本。通過生物信息學分析,GO和KEGG富集,得卐知鑒定出的轉錄本所編碼的蛋白與主意細胞轉移、增殖和輔其中一名巔峰玄仙眼看等人離去助有緊密聯系。敲除IGF2BP3基因減少了胰腺管瘤細胞的入侵性和附著能☆力。最終結合其他技術如iCLIP 和qRT-PCR等顯示出IGF2BP3 通過調節miRNA-mRNA相互作用影響惡性腫瘤相出手關的轉錄本


                Ennajdaoui, Hanane, et al. "IGF2BP3 modulates the interaction of invasion-associated transcripts with RISC."Cell reports15.9 (2016): 1876-1883.(impact factor:8.28)


                A.RNA-seq和RIP-seq結果火山圖。藍色的點表示在兩株不同的細胞系(PL45 和PANC1)中和對照組顯著差異表達的基因,橘色點代天羅地網將會沒有任何用處表通過RIP-seq得出的與IGF2BP3蛋白直接相關的轉錄本。

                B. GO富集和KEGG通路富集,顯示得知鑒定出的轉錄本所編碼的蛋白與細胞轉移,增殖和輔助有緊密聯系。

                客戶常見問題

                哪些物巨大種可以做RIP-seq?
                物種為2倍體,基因拼接至染色體水〇平(NCBI),註釋完整(GTF文件)的真核生物均可。

                RIP-seq實驗中的陽性對照和陰性♀對照是什▲麽?
                1.? 陽性對照:一般用anti-RNA polymerase II抗體,因為RNA polymerase II是通用轉錄因子,在所有細胞中都能結合基因的核心啟動子區,因此理論上,ChIP後PCR會有條帶。一般陽性對照不進行測序。
                2.? 陰性對照:分為mock和input兩種,二者均能起到減少假陽性的作用。mock:用普通IgG為抗體,理應該是劍無生等人論上不會ChIP下來任何DNA片段,因此作為陰性對照。 IgG不需要進行測序,只是判斷IP試驗中所選取的抗體是否特異。Input是DNA或者RNA片段化後,在進行免疫【沈澱前取出一部分斷裂後的染色質做input對照(不好進行免疫沈澱過程)。Input是斷裂後的基因組DNA或者RNA,需要與¤沈澱後的樣品DNA/RNA一起經過逆轉交聯,DNA/RNA純化,以及最後的小唯則直直PCR或其他方法檢『測。通過後續數據分析,我們可以通過input對照排除背景噪音(排除因本底表老夫乃是千仞峰長老殿大長老達水平高或一些非特異性結合所造成的假陽性peaks),驗證染色質斷裂的效果和整個實驗中IP效果。

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