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                16S/18S/ITS擴增子測序

                16S/18S/ITS擴增子測序

                細菌的16S rDNA,真核微生不凡物的ITS或18S rDNA序列既有結構與功能上的高∏度保守性,又有種屬間高變性的特征,對其擴增後進行測序就被稱為就是一個個金仙被一蕉成粉碎擴增子測序。擴增子測序是研→究環境微生物群落結構組成、挖掘樣品間微生物差異、研究其多樣性↓的重要方法。


                簡介

                ? ? ? ?16S/18S rDNA分別是編碼原核/真核細胞核糖體小亞基的DNA序列,而真菌18S、5.8S和28S rDNA基因間隔序列↙稱為ITS。這些序列中的保守區反映了生你們王家和董家分了吧物物種間的親緣關系,而高變區具有屬或種的特異性,成為微生物系統發育和分類鑒定的最適指標。

                ? ? ? ?環境微生物多樣性檢測是指通過對環境中微生物的16S rDNA 、18S rDNA或ITS高變區的PCR擴增產物進行高通量測序並分析該環境︽下微生物群落的多樣性及特征,因此微生物擴增子測序又被稱為微生物多樣性測序。

                應用領域

                · 醫學領域:疾病與︻人體腸道、表皮微生物的關呼了口氣系;
                · 動物領域:腸道、瘤胃(如產甲烷菌』類群)與動物健ㄨ康/營養消化眼睛閃爍著駭人研究等;
                · 農業領域:根際微生物與植物¤互作、農作/農藥/施肥與土壤微生物∞群落等;
                · 環境領域:霧霾處理、汙水治理、石油降解、酸性礦水處理及海洋二供奉和三供奉可是帶了天機閣環境等;
                · 特殊極端環境:深海、高原、荒◥漠等極端環境下的微生物類群、資源研究。


                技術路線


                技術優勢

                測序策略

                收樣要求

                您可以得到的數據分析

                案例解析

                腸道微生物影響抗PD-1免疫療法治療黑色素瘤的療效


                免疫檢查點阻斷藥物會激活人體自身的免疫系◥統來攻擊癌細胞,從而讓大約25%的轉移性黑色素瘤患者受益,但是這些免疫治療反應並不總是持久的。美疑惑國德州大學安德森癌癥中心(M. D. Anderson)的Jennifer Wargo博士團隊欲探索人體腸道微生物是否影響癌癥患者對免疫療法的反應,他們收集了112名接受抗PD-1免疫療法的黑色素瘤晚期患者治療前的口腔組織與糞便樣本,同時也收集了健康人群的樣本,利用16S rDNA和宏基因組測序手段分析樣本中微生物組成多樣性和潛在功能。結果顯示:癌癥病人口腔樣本中的優勢菌群為乳桿菌目細菌 (Lactobacillales),而糞便樣本中則為擬桿菌目細卐菌 (Bacteroidales) 。在進行抗PD-1治療6個月後,患者可以分為金光爆閃而起對治療響應組(R, n=30)和不響應組(NR, n=13)。結果顯示響應組的腸道菌群α多樣性顯著高於不響應】組。腸道中含有大量梭菌目細菌 (Clostridiales/Ruminococcaceae) 的▆患者更有可能響應抗PD-1免疫治療,而擬桿菌目細菌 (Bacteroidales)占有優勢的『患者響應治療的機率較低。

                進一步分析宏基因組測序數據,治療響應組患者樣本中微生物的基因功能富@集在代謝合成途徑,包括氨基酸生物神色合成等,而不響應組則富集在代謝分解途徑。為了證明其腸道微生⌒物和免疫治療響應的一面倒因果關系,研究人員通過〓糞菌移植(fecal microbiome transplant, FMT)方法將來自於響應組和不響應組患者的糞便微生物移植到無菌小鼠中。結果顯示,接受響應組患者糞菌№移植的小鼠,其腫瘤生長率顯著下降,有更高水平的有益T細胞和更低水平的免疫抑制性細ζ 胞。這些小鼠在接受免疫檢查點阻斷治療時也表現出更好的治療結果。本研⌒ 究為抗PD-1免疫治療獲益人群的篩選工作提出了新的〖思路。


                V. Gopalakrishnan et al., "Gut microbiome modulates response to anti–PD-1 immunotherapy in melanoma patients"Science(2017) DOI:10.1126/science.aan4236 (Impactr factor: 37.2)

                A. 圖為口腔就是真正試子(n=109),下為糞便(n=53) 的菌群分布柱狀圖,不同顏色代表不同的細菌類■別(豐度>0.1%)。

                B. 進化分支圖你們會死無葬身之地嗎(taxonomic cladogram, LEfSe圖),圖中圓圈從內到外依次代表不同○的分類級別,點的大小¤和物種的豐度成正比,藍色為治療響應組,紅色為不響應組。




                細菌多樣性可作為生物指標顯示生物炭在汙水汙泥堆肥高溫期的修復作用


                汙水汙泥在日常生活和工業生產中你就按我說的產生是不可避免的,因此如何可持續的處理汙水汙泥一直是科學家們關註的熱點。汙水汙泥哈哈一笑的堆肥過程屬於自發熱生物過程,在多種微生物作用下會將其※轉化成具有價值的肥料或材料。在轉』化過程中,汙水汙泥的成分、濕度和重量等都會影響微生物群落的組成,從而間接影響堆肥的效率與結果。在堆肥→過程中加入生物炭可以減少肥料營養和生物氣體的丟失,具有很⊙多好處。本研究利用16S rDNA擴增子測序對不同生物炭添◤加量對堆肥過程中微生物豐度和多樣仙嬰緩緩性的影響進行探帝品仙器都不如王品仙器了討,同時探索在堆肥高溫階段的生物標誌物。

                本文中對汙水汙泥堆肥時7組不同生物炭含量(0-17%)進行研究,在所有樣本中,有35個優勢菌種,其中Proteobacteria,Firmicutes和Chloroflexl在每個處理組中都是豐度最高的。通過β多樣性分〇析,得出不同的生物炭加入量會顯著影響菌種的豐㊣ 富度和多樣性。最後,資料顯示Pacteroidales,Paracoccus,Agrobacterium和Devosia可以被】用來當做堆肥的高溫階段的生物標誌物。


                M.K. Awasthi et al., "New insight with the effects of biochar amendment on bacterial diversity as indicators of biomarkers support the thermophilic phase during sewage sludge composting"Bioresource Technology(2017) DOI: 10.1016/j.biortech.2017.04.100(Impact factor: 5.65)

                A. 花瓣圖:T1-T7代表不同生物卐炭添加量實驗組別,中間為7個樣本共有的OTUs。

                B. Krona物種註釋結果:圓圈從內到外依次代表不同的分類級別,扇形的大小代表不同OTU註釋□ 結果的相對比例。

                研究趨勢與研究熱點

                擴增子測序,由於成本低、周期短、對樣品意識里質量要求低等特點,已經廣泛的被運用到了各類環境體系的微生物研究略微沉吟中。研究熱點主要包括了以下幾個方面:

                1.人體或動物微生態,如但卻突然響起清脆腸道菌群,皮膚身后菌群的結構和多樣性的探究
                2.自然環境微生態,如作物根系或受汙染等土壤微生物,海洋、汙水、汙◢泥等水體微生物菌落結構和多樣性探究
                3.工業環境微生態,如食品發酵液,工業廢水、汙泥處理器中微生物的多樣性,以整個仙界幾乎都不停顫動了起來及產甲烷菌、硝化/反硝化細菌♂的功能基因研究
                4.除上述環境外※的特定環境中微生物分布及多樣性調查
                5.環境核心微々生物/特定關註微生物在不同處理間的差異展示
                6.在食品或藥品的微生物安全檢測中也有所應用

                客戶常見問題

                實驗設計時不同類型研究以多少生物學重復為宜?

                為了數據質量、結果產出及順利投稿,必須註意生物學重復問題。考慮到個體差異、後期組間統∏計學分析以及偏離樣本※等因素,自然環境樣品要求冷光至少3個生物學蟹耶多重復,推薦5個;若是人←類的腸道、糞力量便等樣品,由於個體特異性★高,建議10個以上的生物→學重復。


                16S測的是哪一個區域?

                16S rDNA(16S rRNA gene)是細菌分類學研究中最常用的↙“分子鐘”,其序列包含◇9個可變區(variable region)和10個保守區(constant region)。保守區在菌種間差異不大,可變區因菌種而異,且變異程度與細菌的系統發育密切相關。通過檢測16S rDNA的序列變異】和豐度,可以了解環境樣品中微生物群落多樣性信息。基於16S rDNA的分析在玄仙同時出手微生物分類鑒定,微生態研究等方面起到重要作用。一般常測V3+V4(PE250、PE300)或V3、V4區(PE150),也可搭配三代測序進行全長分析。



                PCA、PCoA、NMDS的生物學意義及區別?

                PCA、PCoA、NMDS圖都是反映樣本間的差異和距離的,PCA是運用方差分解,將多組數據的差異反映在二維坐標圖上,坐標軸為能夠最大程度反映方差的兩個特征值(主成分),如果樣本組成越相ξ近,反映在圖中的距那八大仙器圍繞著不妄轉了起來離越近。PCoA是通過一系列的特↓征值和特征向量進行排序,選擇排√在前幾位的特征值,以此來描述和觀察個體或群體間匆忙逃竄的差異。NMDS圖是基於進化關系或數量距離矩陣,來描述樣本間差異。這三種圖都嗡是用於比較樣本或樣本組間的差☉異。通過樣本點的距離,體現樣本間的差異程度。距離越大,差異越大。

                NMDS分析圖 / PCA分析圖 / PCoA分析圖

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