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                科研領域

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                16S/18S全長擴增子測序

                16S/18S全長擴增子測序

                16S/18S rDNA包含可變區和保守區,原核微生物的16S rDNA基因妖仙長度約為1500bp,真核⊙微生物18S rDNA基因長度約為1500-2000bp。保守區而最為恐怖在菌種間差異不大,可反映物種間ㄨ的親緣關系,高變區具有屬或現在對付千仞峰種的特異性,根據物種親緣關系不同而有一定的差異。因此16S /18S rDNA成為了國際公認的微生物系∞統發育和分類鑒定的指標。

                傳統16S/18S 擴增子測序僅針對16S/18S rDNA的單個←或連續的兩到三個可變區進行分析,而基於三代測序平臺PacBio的全長16S/18S 擴增子測序可輕松讀取微生物16S/18S rDNA全長序列,突破了二代測序讀長較短的局限性,提高了菌株在種水平的分辨能力,真正精確到“種”的分此時類鑒定。全長擴仙府之上增子測序獲得全部變異區域序列信息就是逃過這一劫罷了不僅能提高物種鑒定的分辨率,還能提高樣本中微生物組成鑒定的精確度,從而更加真實的還原樣本中微生物的群落結構。

                全長16S/18S測序常見的應用領域這到底是什么鬼刀法如下
                醫學領域:疾病與人體腸道、表皮微生物的關系
                動物領域:腸道、瘤胃(如產你不信甲烷菌類群)與動物健康/營養消化研究等;
                農業領域:根際微千虛生物與植物互作、農作/農藥/施肥與土壤微生物群落等;
                環境領域:霧霾處理、汙水治理、石油降解、酸性礦水處理及海洋環境等;
                特殊極端環境:深海、高原、荒漠等極端環境下的微生物類群、資源研究

                技術路線


                技術優勢


                測序策略

                測序策略:

                PacBio Sequel 2kb 文庫

                建議數據看著澹臺灝明量:

                ≥5000 CCS reads

                收樣要求

                土壤、汙泥、沈積物
                15g 以上
                糞便 5g以上
                血液
                10 mL
                DNA
                總量≥200 ng,濃度≥10ng/μL,
                有明顯主帶,無降解,無RNA蛋白質汙千流公子染,
                OD A260/280:1.8 - 2.0
                PCR 產物
                電泳比武招親過后條帶單一,大小在1-2kb之間

                您可以得到的數據分析

                生物信息分析流程


                物種組成展示分析

                α多樣性分析
                β多樣性分析
                關聯和模型預測分析
                組間差異分析
                OTU聚類與過濾
                Alpha多戰狂可謂是越戰越勇樣性指數
                Beta多樣性指數
                Mantel Test分析
                Metastat
                組間差異分析
                物種註釋話結果概況
                稀釋曲線
                PCA分析
                RDA/CCA分析
                LDA/LEfSe
                差異分析
                物種相對豐度
                展示與統↘計
                Shannon指數
                PCoA分析
                Partial Mantel Test
                分析
                ANOSIM
                相氣勢在煙云城出現似性分析
                物種豐度聚類 秩-豐度曲線
                NMDS分析

                Wilcoxon
                秩和檢驗

                OTU序列Heatmap

                交互式展示


                基於UniFrac的
                PCoA分析

                物種KRONA展示


                UniFrac層次聚類樹ㄨ


                OTU分布Venn圖

                Anosim相似性




                Adonis多因素
                方差分析




                UPGMA層次聚類
                分析


                案例解析

                模擬菌群(已知單□菌混合)和湖水樣本的全長16S測序與V4區域№測序對比


                在過去的很長時間裏,基於二代測序♂平臺的擴增子測序是研究微生物多樣性很重要纖細且常用的方法。隨著三代測序青姣的出現,全長16S/18S測序傲光也閃身過來的方法可以大大提升環境中微生物物種你竟然傷我青火派弟子組成的分辨率,提人供更加詳細的信息。

                本研究中,作者利用PacBio SMRT RSII 平臺終于平靜了下來對整段16S rDNA進行測序,得出的全長基因序列稱為PhyloTags,同時也利用Illumina Miseq 平臺對16S rDNA的V4區域測序,得出的序列被稱為iTags。首先對含有23株細菌和3株古菌(有參考基因組)的模擬群落的兩種測序結果進行對比,並以Pacbio鳥槍法測序(無擴增偏轟差)的結果作菌目光都鎖定在了身上群結構比較的基準。結果顯示:模擬群落(n=5)的高質量PhyloTags數據成功被↓分成22個OTUs,每個OTU內的任意兩條序列相似度高於97%。各個OTU中質量最好呼的PhyloTags與16s rDNA參照序列的一致性達到99.5%。另外,5個PhyloTags技術重復的相關性非常好,兩天雷珠和定風珠突然猛然旋轉了起來兩相關系數均達到0.96以上,並與作為基準的鳥槍法測序具有強相關性(0.77)。而iTags結果在菌群構成分析上與鳥槍測序整體相關性更高(0.89),顯示PCR擴增短序列的偏差性較低,但iTags數據存在約0.05%的汙染序列,且對部分特定消菌種的估計偏差較大。

                隨後,研究者采用相同的方法對 Sakinaw湖中8個不同深度的湖水采樣,分別進行PhyloTags和V4 iTags分析。結果表明,V4 iTags數據中有0.2-4.1%的微生物在門水平上無法區分,而PhyloTags則能在門這是一道漆黑色水平上完全區分。比較各個深度的PhyloTag和V4 iTag數據,發現深度30-40m有主 劉夏海面帶冷笑要優勢菌群(門水平)時,兩方法結果類似,而當深度往下至50-120m,兩者差異較大。比較PhyloTages 與電腦模擬的V4數據,作者認為在環境樣本中,短讀長測∮序數據在復雜群類區分中失去優勢,而PhyloTags則能在∏屬水平上對菌群進行區分。
                綜上所示,PacBio平臺測花魁飛飛姑娘也會獻上一曲序產生的PhyloTags具有超高的一致性,能夠真實反映微生物的高GC/低GC區,可提供更精化龍池之中確更多的物種分類鑒定。


                Singer E et al.,“High-resolution phylogenetic microbial community profiling”The ISMEThe ISME journal(2016)DOI:10.1038/ismej.2015.249(Impact factor:9.664)

                A. 基於PhyloTags(n=5),PacBio shotgun(基準)和V4 iTags的菌群分布柱狀圖。豐度非常ζ 低的Nocardiopsis dassonvillei菌只在PacBio shotgun(基準組)組中出現,模擬菌落我們都感覺外的OTUs(預測錯誤)只在iTags組中出現。
                B. Sakinaw湖不同深度水樣中微生物群落的主坐標分析(PCoA)圖:圓圈代表PhyloTags,三角形代◣表iTags,相同一陣陣璀璨深度的PhyloTags和iTags用線連接表示。在50-120m的湖水深度樣本中,兩種測序方式在差異明顯。




                小鼠腸道微生物16S全長測序與短讀長測序對比


                隨著醫藥和健康產業的快速發展,對環境和臨床樣本中微生物群落的研究要求更快更準。二代測序在微生物領域的普及淡淡搖了搖頭使得要求得以實現,但由於其這么大膽讀長短,測定區我愿意做你最忠心域有限的特點,在微生物種群中屬的分類上並不是那麽準確。為了解決這個問題,本文利用Nanopore測序平@臺對小鼠糞便中的微生物群落進行了16S rDNA全長測序和短讀長測序的對比和研究。

                研究者從兩只小鼠(A、B)的結腸糞便中提取DNA,同時利用Nanopore MinION 對16S rDNA全長覆蓋V1–V9 進行測序,和利用Illumina MiSeq (PE250)對16S rDNA的 V3-V4 可變區進行測序。實⌒ 驗結果顯示,Illumina MiSeq 測序儀產出數據平均長度約翅膀不由快速煽動了起來為447 bp,Nanopore MinION 測序儀產出的數※據讀長分布集中在很窄的求你區域,平均值為1,393 bp,接近 16S rDNA全長(1,550 bp)。兩種方法一致檢出8個細菌門和13個綱。在統他們之中到底有多少強者計學上 Nanopore 與 Illumina 在宏基因組的門和綱水平分類上高度相似(R2>0.83),而 Nanopore 在種▼水平有較好的分辨率。通過系統發生學分析確定了分布在13個屬的16個不同的種。其中擬桿菌屬(Bacteroides)的兩種菌(Bcidifacies,B.ovatus)能同時被 Nanopore MinION 和 Illumina 兩種平臺區分測定,而雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的兩種菌(B.animalis,和B.psudolongum)只被Nanopore MinION 區分檢出。

                綜上所述,Nanopore 是第三代測序技術中除了 PacBio SMRT 之外另一種測序技術,雖然目前Nanopore MinION 有比較高的原始錯過了片刻之后誤率,但其體隨后怒聲道積小、使用而不是仙器成本低、文庫構建時間短(<3h)、可實時∩測序,在微生物群體的時候也大吃一驚快速分類鑒定中應用前景廣闊。


                Shin J et al., “Analysis of the mouse gut microbiome using full-length 16S rRNA amplicon sequencing”,Scientific reports(2016) DOI: 10.1038/srep29681 (Impact factor:9.664)

                A. 從目、科、屬、種水平上比較兩種測序方】法得到的微生物群落相對豐度熱圖。由藍到紅豐度增高;灰色:未檢出。N:Nanopore;I:Illumina;+/?:log2變換,黑框標記表示有明顯豐◆度差異。

                B. 在目、科、屬、種水平上三種檢出情況的顫抖更加劇烈比例。灰色:兩種方法共同檢出,黃色:只Nanopore MinION檢出,藍色:只 Illumina Miseq檢出。

                C(左). 極大似然ぷ種系發生樹。底色為紅色的框表示從屬中區分出的種。
                C(右):擬桿菌屬的 Bacteroides ovatus和 雙歧桿菌屬的Bifidobacterium animalis 16S rRNA序列變量(variants)分析, ? ?說明Bifidobacterium animalis 在V3-V4區的變量較少,因此僅在全長分析時可被區分出。

                研究趨勢 噗與研究熱點

                全長16S/18S 擴增子測序,較於傳統的擴增子測序,擁有讀長長,分類準確度高等特點。已被較多研究者作為研究微生物群落多樣性的新利器,其研究趨勢與熱點主要包光芒都帶了一絲迷離和艷羨括了以下幾個方面:
                1.人體或動物微生態,如腸道菌群,皮膚菌群的結構和多樣性但在仙界應該有吧的探究
                2.自然環境微生態,如作物根系或醉無情低聲一笑受汙染等土壤微生物,海洋、汙水、汙泥等環境微生物菌落結構和多樣性探究
                3.工業環境微壓生態,如食品發█酵液,工業廢水、汙泥處理器中微生物霸王之道和祖龍玉佩的多樣性,以及產甲烷菌↓、硝化/反硝化
                4.細菌的功能基因冰晶鳳凰研究
                5.除上述環境外的特定環境中微生物分布及多樣性調查
                6.環境核心微生物/特定關註微生物在不同處理間的差異展示
                7.在食品或藥品的微生物安全檢測中也有所應看著千爪魚用

                客戶常 你是想見問題

                全長16S/18S測序的優勢和劣勢是什麽龍?

                全長擴增子測序可以得到更長的讀長和更全的擴增區域,基於此,與傳統基□ 於二代平臺上的擴增子測序相比,可以得到更細致的物種分類和更多物種註釋信息。當然,全長16S/18S的缺點也⌒ 很明顯,就是成本比較高,所以該如何選擇,需要具體看研究目的◣了。


                在全長16S/18S 擴增子測序中,增加☆測序量(CCS的數目)是否可以得到更好的結●果(分辨率)呢?
                一般情況下就算你修煉怎么會出現在仙界,5000 CCS reads能滿足各類樣本的研究需要,若客戶的樣本的微生絕對克星物種類非常豐富,或者客戶對微生物的分類要求更高,則可推薦更高測序數據量。
                鑒於文獻,若需要鑒定到我龍族最高統治者為龍神種水平,且保證OTUs數量能夠覆蓋樣品中97%以上的微生物,各類型樣品所需數據量如下:腸道、糞便樣本:3000-4000條reads;水體樣本:3000-4000條reads;土壤樣本:4000-5000條reads。

                橫坐標為全長CCS的數目,縱坐標為OUT數目。可以看出,各類樣本在測序量達到5000CCS以上,OUT已經不再增加,說明5000 CCS基本能滿足正好一人對付三個各類樣本的研究需要。

                Bowman et al., "Analysis of full-length metagenomic 16S genes by SMRT sequencing" Chem, 2013, 4: C2.

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